補體因子H關鍵結構域野生型及突變型克隆載體的構建表達與功能初探

【摘要】：目的 構建并表達補體因子H (complement factor H,CFH)關鍵結構域蛋白,即野生型短同源重復序列(shortconsensus repeats,SCR)7和SCR19-20,突變型SCR7 Y402H、SCR19-20 R1210C、SCR19-20 R1215Q,探討CFH基因突變導致補體過度激活疾病的可能機制。方法 采用In-Fusion反應,將編碼SCR7 (386～446位氨基酸)和SCR19-20 (1 107～1 231位氨基酸)的cD NA序列分別克隆入pE T-47b (+)載體,定點突變引入3個預期突變位點Y402H、R1210C和R1215Q,再將攜帶pE T-47b (+)載體6-His純化標簽的CFH-SCR7和CFH-SCR19-20野生型和突變型重組質粒導入穿梭載體pN CMO2,在短芽孢桿菌中進行上述蛋白結構域的表達、Ni-NTA樹脂純化、SDS-PAGE電泳和蛋白質印跡法鑒定。通過檢測其與肝素的親和能力初步鑒定野生型與突變型的功能差異。結果 成功構建了CFH關鍵結構域SCR7和SCR19-20的野生型和突變型重組表達載體pN CMO2-SCR7、pN CMO2-SCR19-20、pN CMO2-SCR7 Y402H、pN CMO2-SCR19-20 R1210C、pN CMO2-SCR19-20 R1215Q。5種重組體均高效表達且經抗6-His抗體和特異性抗CFH單克隆抗體進行蛋白質印跡法實驗驗證均為相應正確蛋白。SCR7 Y402H比野生型的肝素親和力強,R1210C和R1215Q均比SCR19-20野生型親和力弱。結論 成功構建并表達了CFH SCR7和SCR19-20突變體,初步鑒定了突變蛋白結構域的功能,為體外進一步研究CFH基因突變致補體過度激活類疾病發生的可能機制奠定了實驗基礎。